配制環凱培養基必須使用高質量的水，如石英玻璃蒸餾器經三次蒸餾或超純水凈化裝置制備的水。因為其缺乏了血清中天然成分中和毒素、保護細胞的大分子，既便水中的有毒物質含量甚微，也可能對細胞產生致死性損害。這是無血清培養能否成功的關鍵因素之一。

 

　　補充因子是代替血清的各種因子的總稱。環凱培養基必須補加3-8種因子，胰島素和轉鐵蛋白是必須補充因子，其他多數為輔助作用的因子。按其功能不同，補充因子可分為五類：

 

　　1、結合蛋白：常見如轉鐵蛋白和牛血清白蛋白。轉鐵蛋白與細胞上的轉鐵蛋白受體結合是細胞獲取鐵元素的主要來源。白蛋白與脂類、激素、維生素、金屬離子和生長因子結合后可調節上述物質在無血清培養基中活性的作用，此外，由于牛血清白蛋白一般添加量比較大，可增加培養基的粘度，保護細胞免受機械損傷。

 

　　2、激素和生長因子：很多細胞用無血清培養時需要加入激素，如胰島素、生長激素、胰高糖素等。胰島素是重要的細胞存活因子，與細胞上的胰島素受體結合后可促進RNA、蛋白質和脂肪酸的合成，抑制細胞凋亡。此外，雌二醇、孕酮等也是無血清培養基中常添加的補充因子。

 

　　3、酶抑制劑：培養貼壁生長的細胞，需要用胰酶消化傳代，在無血清培養基中須含酶抑制劑，以終止酶的消化作用，達到保護細胞的目的。

 

　　4、貼壁因子：許多細胞必須貼壁才能生長，這種情況下無血清培養基中一定要添加促貼壁和擴展因子，一般為細胞外基質，如纖粘連蛋白、膠原蛋白等。它們還是重要的分裂素以及維持正常細胞功能的分化因子，對許多細胞的繁殖和分化，起著重要作用。纖粘連蛋白主要促進來自中胚層細胞的貼壁與分化，這些細胞包括成纖維細胞、肉瘤細胞、粒細胞、腎上皮細胞、腎上腺皮質細胞、CHO細胞、成肌細胞、CHO細胞等。

 

　　5、其他補充因子：一些細胞培養使用的無血清培養基還需要補充微量元素、維生素、脂類等低分子量物質。